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高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌发生的直接原因，然而HPV感染后多数可被宿主免疫机制清除，只在部分病例中HPV感染持续存在并与宿主细胞DNA整合，导致宿主细胞癌变。HPV表观遗传学的改变在病毒整合及致宿主细胞癌变中起一定作用。对目前有关HPV表观遗传学特点在影响HPV自身表达和宫颈病变进展中作用的文献加以综述，了解HPVDNA甲基化状态在宫颈癌发生、发展中的作用。HPV基因表观遗传学状态有可能成为临床诊断和判断预后的分子标记物。
宫颈肿瘤；人乳头瘤病毒16；DNA甲基化；基因沉默
宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，全世界每年新发宫颈癌病例约46.6万，中国有13万之多。高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌发生的直接原因。然而，HPV感染后多数可被宿主免疫系统清除，仅少部分持续存在。而且病毒感染宿主上皮细胞后开始是以环状DNA方式自我复制，随着病情进展有些HPV整合到宿主细胞DNA中致宿主细胞异常分化终致癌变。同样的HPV基因组感染宿主后生物学行为却有很大差异，所致临床结局也大不相同，因而引发了对HPV的进一步研究。表观遗传是指非基因序列改变所致基因表达水平的变化。表观遗传调控分子基础有两个方面：即针对DNA本身的修饰和对组蛋白的修饰。研究发现，表观遗传修饰影响细胞生长、分化、凋亡、转化以及肿瘤发展相关基因的转录。近年来有学者猜测，HPV表观遗传学改变可能是影响病毒活性及致病性的原因，因而引发了相关的研究。
1宫颈癌细胞系中HPV表观遗传学研究
对宫颈癌细胞系的研究揭示了染色体整合型HPV基因的部分表观遗传学规律。已建立的含HPV16宫颈癌细胞系含有不同的整合病毒拷贝，CaSki和SiHa细胞分别含有＞个和2个HPV16基因拷贝。SiHa细胞中2个整合拷贝均有转录活性，CaSki细胞中仅有1个位于染色体14的整合位点的拷贝具有转录活性，在5-氮杂胞甙作用下，CaSki细胞中多余的沉默拷贝可获得转录活性，证实了DNA甲基化可导致多余拷贝的长期沉默。这一理论也可以由病毒启动子和增强子甲基化状态证实，例如这些区域CpG位点在CaSki细胞中的甲基化明显超过SiHa细胞。最近关于CaSki细胞系的研究表明，HPV16通过自身调节E2、E6/E7甲基化水平来调节病毒复制过程，使含有多拷贝HPV16基因的CaSki细胞表现出单一稳定的基因型。HPV16中启动子、增强子和E2基因的甲基化状态可能决定了病毒的表达。
在已建立的含有HPV18宫颈癌细胞系中，HeLa细胞含有大约50个整合病毒拷贝，C4-I细胞含有少数整合病毒拷贝，此两种细胞系HPVDNA启动子和增强子均为低甲基化，但在L1区域的甲基化水平存在差异，在HPV18阳性的宫颈癌标本中L1区域甲基化水平显著高于无症状感染者，在病毒整合至宿主细胞后，L1区域CpG甲基化可使其余的HPV18拷贝失去活性。因而，虽然HPV16和HPV18的转录因子和位于长控制区（LCR）的转录元件是一样的，但是通过不同的DNA甲基化模式调节病毒的表达，在病毒整合至宿主细胞中发挥着控制作用。
有学者研究发现CaSki和SiHa细胞中，端粒反转录酶启动子起始部位处于低甲基化状态导致细胞永生化。而这种低甲基化状态受到癌基因E6调控，当E6被沉默后，研究部位甲基化水平升高，细胞永生化被终止。
2宫颈癌变进程中HPV表观遗传学表现
目前关于HPV甲基化的临床研究多集中于HPV16型，研究结果是有限的，并且具有一定争议。Hublarova等应用特异性限制性核酸内切酶McrBC法检测HPV16的E6启动子甲基化状况，并用实时聚合酶链反应（PCR）检测相应的E6表达情况。发现无症状携带者甲基化率为81%，宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ）为62.5%，CINⅡ/Ⅲ为31.5%，癌症患者为43.4%，无症状感染者甲基化程度最高，与各病变组比较差异有统计学意义。E6mRNA表达与甲基化发现相一致，未甲基化组E6mRNA明显高于甲基化组。这项研究选择的引物检测了6个CpG位点甲基化状况，包括位于E2结合区域的位点，其他5个CpG位点（31，37，43，52和58）位于启动子部分，其中每个位点的甲基化作用均可以抑制E6启动子从而降低E6转录。由于HPV16甲基化状态调节E6致癌蛋白的表达，与CIN进展密切相关，认为检测HPV16甲基化状态有可能成为判断HPV感染后是否进展的辅助标记。相类似的研究结果证实，HPV16E6启动子及增强子区域低甲基化是感染后发展为宫颈疾患独立的危险因素。此外，Patel等用亚硫酸盐测序技术检测89例HPV16阳性患者HPV16的甲基化状态，在细胞学正常感染者中E6启动子和增强子甲基化水平显著高于细胞学异常组，细胞学异常者HPV16呈低甲基化状态，与Xi等和MazumderIndra等研究结果相一致。Missaoui等研究表明，与CIN病变相比较宫颈癌组织中HPV16整体呈现低甲基化状态，认为低甲基化是疾病进展的原因。
然而，Kalantari等检测例临床标本中HPV16甲基化状况得出与以上研究结果相反的结论，该研究对HPV16的LCR区域和部分L1片段上至85之间的19个CpG位点的甲基化水平进行绘图分析。恶性组中，，31，37，52和58位点甲基化比例显著高于无症状感染者，CIN组位点甲基化率也高于无症状感染者。总的来讲，在几乎所有的位点中恶性组甲基化程度高于CIN组，推测可能是因为在肿瘤形成过程中病毒基因需大量增加，因而CIN中HPV多为游离状态复制活跃的状态，与宫颈癌组相比表现为低甲基化，而在宫颈癌中HPV16多为整合状态，HPV16高甲基化状态可能是由于宿主细胞对外来整合基因的基因防御机制作用的结果，认为HPV甲基化与HPV致肿瘤基因表达和疾病进展有关。有研究者应用焦磷酸测序法检测了HPV16基因组中65个CpG位点甲基化状态，发现分别位于L1、L2和E2/E4片段的9个位点的甲基化水平在CINⅢ组显著高于无症状感染组。认为这些位点甲基化水平升高与HPV16感染后发展为宫颈癌前病变相关。
Ding等应用甲基化测序方法研究宫颈癌CaSki和SiHa细胞系及临床标本中HPV16基因LCR中15个CpG位点甲基化水平，发现宫颈癌中HPV16LCR甲基化水平是低度鳞状上皮内病变（LSIL）的10倍。分析可能由两个机制造成此现象：第一，甲基化作用阻断了HPVE2结合位点，E2基因失去了对E6/E7的抑制作用因而导致癌变；第二，高度甲基化可以解释为是宿主细胞对染色体整合病毒的一种基因防御现象。有研究证实，HPV16LCR在高分化细胞中通常为低甲基化状态，而在低分化细胞中常为高甲基化状态，特别是在E2结合位点（E2bindingsites，E2BSs）。随着HPV感染后疾病的进展细胞分化受到限制，不成熟的和异型的细胞在病灶中逐渐占主导地位，更多的HPV基因整合到宿主基因中。宿主细胞防御系统被激活，甲基化活性增强，整合基因成为甲基化的靶点。然而，LCR甲基化机制并未完全阻止宫颈癌致癌基因E6/E7表达，是因为HPVDNA整合到宿主细胞后，其中仍有部分未被甲基化，HPV致癌基因仍能表达。同时，在Ding等的实验中，经去甲基化作用E6表达增加2倍，说明LCR甲基化只是部分限制了E6基因表达，并不能够完全阻止癌变的发生。和以前研究结果一致，位于E6/E7启动子和增强子之间的两个核小体连接处CpG位点只有轻度甲基化。此连接区域构成了HPV复制的起始部分，而且接近上皮细胞分化中转录的主要调节器。此位点去甲基化的生物学意义目前还不清楚。
另外一项早期研究应用甲基化敏感HpaⅡ/MspⅠ限制性消化技术研究最接近E6/E7启动子p97的E2结合位点E2BS-1，也发现在宫颈癌中的甲基化程度为56.14%，远高于正常对照组的20%。E2BS-1甲基化使正常的E2蛋白不能与之结合失去了抗肿瘤活性，导致宫颈癌发生。
近来，Kalantari等研究HPV16L1区域甲基化与病毒基因染色体整合间的关系，以21例HPV16阳性且宫颈细胞学检查异常者为研究对象，应用亚硫酸盐测序技术检测L1区域甲基化状况并检测了HPV16整合状态，发现HPV16L1片段高甲基化者DNA整合发生高于低甲基化和未甲基化者。由于L1区域甲基化与HPV病毒整合至宿主染色体存在一定的关系，认为L1区域甲基化有可能成为预测宫颈癌进展的潜在指标。与此结果相一致，另外一项研究也发现，HPV16L1开放性阅读框甲基化水平在CINⅢ中显著增高，认为这一特点可能使其成为宫颈癌及癌前病变的辅助诊断指标。
3结语
总之，目前对HPV甲基化状况与其致病作用相关性的研究尚有争论，可能与研究者所使用方法和研究的具体CpG位点差异有关。HPV甲基化状态作为辅助临床诊断和判断预后的分子标记物的可行性尚需进一步大规模的前瞻性研究来证实。（文章来源：国际妇产科学杂志）
